Studio demolisce Test RT PCR per rilevare SARS-CoV-2 errori scientifici generano 97% di falsi positivi

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La revisione paritaria esterna del test RTPCR per rilevare SARS-CoV-2 rivela 10 principali difetti scientifici a livello molecolare e metodologico: conseguenze per risultati falsi positivi.

FONTE STUDIO

Nella pubblicazione intitolata “Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR” (Eurosurveillance 25 (8) 2020) gli autori presentano un flusso di lavoro diagnostico e protocollo RT-qPCR per il rilevamento e la diagnostica del 2019-nCoV (ora noto come SARS-CoV-2), che sostengono di essere convalidato, oltre ad essere una solida metodologia diagnostica per l’uso in ambienti di laboratorio di sanità pubblica. 

Alla luce di tutte le conseguenze derivanti da questa stessa pubblicazione per le società di tutto il mondo, un gruppo di ricercatori indipendenti ha eseguito una revisione punto per punto della suddetta pubblicazione in cui

1) tutti i componenti del progetto di test presentato sono stati sottoposti a controlli incrociati, 2) il Le raccomandazioni del protocollo RT-qPCR sono state valutate rispetto alla buona pratica di laboratorio e 3) i parametri sono stati esaminati rispetto alla letteratura scientifica pertinente che copre il campo. 

Il protocollo RT-qPCR pubblicato per il rilevamento e la diagnostica di 2019-nCoV e il manoscritto soffrono di numerosi errori tecnici e scientifici, tra cui un disegno del primer insufficiente, un protocollo RT-qPCR problematico e insufficiente e l’assenza di una convalida accurata del test. Né il test presentato né il manoscritto stesso soddisfano i requisiti per una pubblicazione scientifica accettabile. Inoltre, non vengono menzionati gravi conflitti di interesse degli autori. Infine, il brevissimo lasso di tempo tra la presentazione e l’accettazione della pubblicazione (24 ore) significa che un processo sistematico di revisione tra pari non è stato eseguito qui o di scarsa qualità problematica. Forniamo prove convincenti di numerose inadeguatezze, errori e difetti scientifici.

Considerando le imperfezioni scientifiche e metodologiche qui presentate, siamo fiduciosi che il comitato editoriale di Eurosurveillance non abbia altra scelta che ritirare la pubblicazione.

Che cosa è importante quando si progetta un test RT-PCR e il test quantitativo RT-qPCR descritto nella pubblicazione Corman-Drosten?

1. I primer e le sonde:

a) la concentrazione di primer e sonde deve essere del range ottimale
(100-200 nM)
b) deve essere specifica per il gene target che si desidera amplificare
c) deve avere una percentuale ottimale di contenuto di GC rispetto alle basi azotate totali ( minimo 40%, massimo 60%)
d) per la diagnostica virale almeno 3 coppie di primer devono rilevare 3 geni virali (preferibilmente il più distanti possibile nel genoma virale)

2. La temperatura alla quale avvengono tutte le reazioni:

a) Temperatura di fusione del DNA (> 92 °)
b) Temperatura di amplificazione del DNA (TaqPol specifica)
c) Tm; la temperatura di annealing (la temperatura alla quale i primer e le sonde raggiungono il legame / distacco target, non deve superare i 2 ̊C per coppia di primer). Tm dipende fortemente dal contenuto GC dei primer

3. Il numero di cicli di amplificazione (inferiore a 35; preferibilmente 25-30 cicli);

In caso di rilevamento di virus, >35 cicli rilevano solo segnali che non sono correlati al virus infettivo come determinato dall’isolamento in coltura cellulare [rivisto in 2]; se qualcuno viene testato dalla PCR come positivo quando viene utilizzata una soglia di 35 cicli o superiore (come nel caso della maggior parte dei laboratori in Europa e negli Stati Uniti), la probabilità che tale persona sia effettivamente infetta è inferiore al 3%, la probabilità che detto risultato è un falso positivo è del 97% [rivisto in 3]

4. Validazioni biologiche molecolari; I prodotti PCR amplificati devono essere convalidati eseguendo i prodotti in un gel con un righello del DNA o mediante sequenziamento diretto del DNA

5. È necessario specificare controlli positivi e negativi per confermare / rifiutare il rilevamento di virus specifici

6. Dovrebbe essere disponibile una procedura operativa standard (SOP)